轉(zhuǎn)染試劑是一種試劑 轉(zhuǎn)染試劑是一種適合于把質(zhì)?;蚱渌问降暮怂?以及核酸蛋白復合物轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的真核細胞中的陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑。
轉(zhuǎn)染試劑優(yōu)點
1、轉(zhuǎn)染效率高,重復性好,操作簡單。
2、無明顯細胞毒性,用 轉(zhuǎn)染細胞后,大多數(shù)細胞72小時內(nèi)不更換培養(yǎng)液無明顯細胞毒性。
3、 轉(zhuǎn)染試劑對于貼壁細胞和懸浮細胞都適用,并且可以用于穩(wěn)定表達細胞株的篩選。
使用說明
1. 細胞培養(yǎng):以293T細胞為例,轉(zhuǎn)染前一天(20-24小時) ~0.4×106 細胞(具體的細胞數(shù)量據(jù)細胞大小和細胞生長速度而定)鋪到六孔板內(nèi),使第二天細胞匯合度(confluent)能達到約50%~70%。
2. 在進行下述轉(zhuǎn)染步驟前,把六孔板每孔內(nèi)換成新鮮細胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)液的體積約為2 ml。
注:其他培養(yǎng)介質(zhì)培養(yǎng)液體積參見《各種培養(yǎng)介質(zhì)下 轉(zhuǎn)染DNA詳表》,抗生素、Glutamine等對 轉(zhuǎn)染并無影響。如果LipoFiter對目的細胞毒性較大,轉(zhuǎn)染試劑建議去除轉(zhuǎn)染體系內(nèi)的抗生素。
3. 把 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑輕輕混勻。
4.對于待轉(zhuǎn)染的六孔板中一個孔的細胞,取一只潔凈無菌離心管,加入4 mg質(zhì)粒DNA(其他培養(yǎng)介質(zhì)DNA用量參見附表)到250 ml DMEM溶液,用槍輕輕吹打混勻。
5. 取另一只潔凈無菌離心管,加入250 ml DMEM溶液,再加入10 ml (其他培養(yǎng)介質(zhì) 用量參見附表),用槍輕輕吹打混勻,室溫放置5分鐘。
6. 將步驟4與5中的DNA溶液與 溶液混合,用槍輕輕吹打混勻。注意:不可Vortex或離心。
7. 室溫孵育20分鐘。有可能出現(xiàn)絮狀沉淀物,屬正?,F(xiàn)象,不會影響轉(zhuǎn)染效率。
8. 轉(zhuǎn)染試劑無論是貼壁細胞還是懸浮細胞,均把500 ml -DNA混合物全部加入六孔板的一個孔內(nèi)。加入時注意盡量均勻加入到整個孔內(nèi),隨后輕輕“8”字搖擺混勻。
注:針對貼壁細胞,如上述所說,只需將 -DNA復合物加入細胞中孵育6小時再換液即可。若是轉(zhuǎn)染懸浮或半懸浮細胞,則推薦通過平角離心轉(zhuǎn)染法,即將適量的 -DNA復合物加入細胞培養(yǎng)皿后(步驟8),封口膜封好,放入平角離心機,低速(200 g)離心1.5 小時,然后放入培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)6小時再換液即可。
9. 細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6-12小時后,去除含有 -DNA的無血清培養(yǎng)液。每孔加入2 ml新鮮含血清的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
注:通常 -DNA混合物和細胞一起孵育6小時已經(jīng)足夠產(chǎn)生較高的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染試劑大多數(shù)細胞和 -DNA一起培養(yǎng)長達72小時未見明顯細胞毒性。但轉(zhuǎn)染后6小時更換新鮮培養(yǎng)液對于一些生長非??焖俚募毎兄谔岣咿D(zhuǎn)染效率。對一些比較易于轉(zhuǎn)染的細胞如HEK-293T細胞,換液可視細胞生長狀況而定,無需為提高轉(zhuǎn)染效率而換液。
10. 轉(zhuǎn)染后續(xù)處理:
1) 對于基因表達,再培養(yǎng)24-40小時后即可檢測轉(zhuǎn)染效果,如轉(zhuǎn)染帶GFP或者其他熒光基因的表達載體,可用熒光顯微鏡觀測細胞轉(zhuǎn)染效率。
2) 轉(zhuǎn)染試劑用于篩選穩(wěn)定表達細胞株,則在轉(zhuǎn)染后24小時即可加入適當?shù)暮Y選藥物,例如G418或Puromycin(嘌呤霉素)等,進行穩(wěn)定表達細胞株的篩選。