熒光探針是在紫外-可見-近紅外區(qū)有特征熒光，并且其 熒光性質(zhì)可隨所處環(huán)境的性質(zhì)，如極性、折射率、粘度等改變而靈敏地改變的一類熒光性分子。
常用于熒光免疫法中標記抗原或抗體，亦可用于微環(huán)境，如表面活性劑膠束、雙分子膜、蛋白質(zhì)活性位點等處微觀特性的探測。通常要求探針的摩爾吸光系數(shù)大，熒光量子產(chǎn)率高；熒光發(fā)射波長處于長波且有較大的斯托克斯位移；用于免疫分析時，與抗原或抗體的結(jié)合不應(yīng)影響它們的活性。
熒光探針的化學(xué)性質(zhì)：熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)制劑可分為兩種：熒光探針和熒光染料。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。
實時熒光PCR技術(shù)靶基因的確定及引物和探針的設(shè)計原則
1.靶基因的確定：選擇檢測組共有的基因以避免檢測的假陰性。
2.檢測片段的確定：選擇檢測組內(nèi)的保守 、組間特異的序列作為引物探針的設(shè)計位置。片段長度70-150bp。
3.引物：長度17-25bp;GC含量30-80%；退火溫度(Tm值)58-60℃；避免穩(wěn)定的引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)；序列不能出現(xiàn)連續(xù)的G，3’端避免G或C，后5個堿基內(nèi)避免兩個以上的G或C。
4.熒光探針：長度20-30bp(Taqman)或16-25bp(MGB)；GC含量30-80%；Tm值為68-70℃；避免穩(wěn)定的二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)；5’端不能是G；位置盡量靠近上游引物；選擇波長差異較大或Fam的熒光標記。
