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關(guān)于我們首頁 > 產(chǎn)品中心 > 生化試劑 > 抗生素 > FS0019G418 Sulfate遺傳霉素(抗生素)
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  • G418 Sulfate遺傳霉素(抗生素)
  • 型號(hào):FS0019
  • 報(bào)價(jià):400
  • 地區(qū):上海
  • 0
  • G418 Sulfate遺傳霉素(抗生素),CAS:108321-42-2也稱作Geneticin(遺傳霉素),是一種結(jié)構(gòu)類似于慶大霉素B1(Gentamycin B1)的氨基糖苷類抗生素,通過影響80S核糖體功能和阻斷延伸步驟來干擾蛋白合成,對(duì)原核和真核等細(xì)胞都有毒性 ,包括細(xì)菌、酵母、高等植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞 ,也包括原生動(dòng)物和蠕蟲.
  • 021-34600120
產(chǎn)品詳細(xì)介紹

G418 Sulfate遺傳霉素(抗生素)
產(chǎn)品簡(jiǎn)介:

產(chǎn)品貨號(hào)產(chǎn)品名稱規(guī)格 報(bào)價(jià)(元)  
FS0019-1GG418 Sulfate遺傳霉素(抗生  素)                       1g 400.00
FS0019-5GG418 Sulfate遺傳霉素(抗生素)5g 1600.00

    哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,當(dāng)抗性基因neo被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組后 ,使其編碼表達(dá)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(amino-glycoside 3’-phosphotransferase,APH(3)II)。此酶通過共價(jià)修飾G418的氨基或羥基功能,抑制抗生素-核糖體間的相互作用,從而使得抗生素失活。這一特性賦予細(xì)胞產(chǎn)生抗性。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選實(shí)驗(yàn),需要建立殺滅曲線(劑量反應(yīng)曲線)確定殺死無抗性細(xì)胞的zui低有效濃度。植物細(xì)胞中,通過轉(zhuǎn)染攜帶nptII基因的抗性質(zhì)粒孵育其抗性。nptII基因也能編碼表達(dá)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶,這個(gè)酶使得多種抗生素喪失活性,包括G418,卡那霉素和巴龍霉素。

產(chǎn)品屬性:

英文同義名(English synonym)

中文同義名(Chinese synonym)

Antibiotic G418; G418 Sulfate;

G418硫酸鹽;遺傳霉素;

CAS號(hào)(CAS No.)108321-42-2
分子式(Molecular formula)C20H40N4O10·H2SO4
分子量(Molecular weight)692.7
外觀(Appearance)白色粉末
純度(Purity)~98%

活力(Potency)(anhydrous)

溶解性(Solubility)

>700 μg/mg

溶于水

結(jié)構(gòu)式(Structure) 

G418 Sulfate遺傳霉素(抗生素)

運(yùn)輸與保存方法

常溫運(yùn)輸。粉末4℃避光保存,避免受潮,否則會(huì)降低抗生素活力。

使用方法

1. G418儲(chǔ)存液的配制(50 mg/mL,活性濃度)

1.1活力單位的換算

根據(jù)此公式進(jìn)行換算:(1000/A0)×A1=A2,其中A0是G418的活力值(Potency),因批次而異??梢娕螌?duì)應(yīng)的質(zhì)檢報(bào)告,或者瓶子上的標(biāo)簽。A1是想配制的活性G418濃度。A2是實(shí)際稱重的粉末與體積比濃度。

比如若所用批次的G418 活力值為:750 µg/mg,要配制50 mg/mL的G418活性濃度,則實(shí)際要配制的粉末濃度為1000/750×50 mg/mL=66.33 mg/mL。

如果配制10 mL的G418儲(chǔ)存液(活性濃度,50 mg/mL),則需要稱取663.3 mg粉末。

1.2除菌和保存

根據(jù)上述換算得到的實(shí)際粉末稱重量,加入10 mL無菌去離子水內(nèi)使其*溶解。

先用5 mL無菌去離子水預(yù)濕潤(rùn)0.22 μm針頭式過濾器,除盡水。之后使用此濾器過濾,除菌后分裝成單次使用的小量(如1mL)放到-20℃凍存,1年穩(wěn)定。

不要對(duì)混濁的溶液進(jìn)行過濾,因?yàn)榛鞚岬娜芤阂馕吨?溶解,過濾過程中會(huì)造成藥物損失,降低終液的活性。不建議使用液體培養(yǎng)基,NaCl,磷酸鹽溶液或者有機(jī)溶劑來制備儲(chǔ)存液。

2. 常用篩選濃度

一般來說,剛開始篩選轉(zhuǎn)化子需要高濃度的G418,并用一個(gè)較低濃度的G418用于維持培養(yǎng)。生長(zhǎng)條件,細(xì)胞類型和其他的環(huán)境因素都可能影響G418的用量,因此*次使用的實(shí)驗(yàn)體系建議通過殺滅曲線(kill curve),即劑量反應(yīng)性曲線,來確定篩選濃度。

通常情況,哺乳動(dòng)物細(xì)胞篩選范圍200-2000 μg/mL;植物細(xì)胞:10-100 μg/mL;酵母細(xì)胞:500-1000 μg/mL;

以下是一些細(xì)胞類型使用篩選使用的濃度,可做參考:

細(xì)胞類型激活濃度應(yīng)用引用文獻(xiàn)
網(wǎng)柄菌屬a) 10 μg/mL
b) 30 μg/mL

a)培養(yǎng)在培養(yǎng)液中;

b)培養(yǎng)在凍干細(xì)菌上;

Hirth,et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., v. 79, 7356-7360 (1982).
哺乳動(dòng)物a) 400 -1000 μg/mL
b) 200 μg/mL

a)用于篩選

b)用于維持生長(zhǎng)

Canaani and Berg, Proc. Natl. Acad. Sci., v. 79, 5166-5170 (1982).
植物a) 25-50 μg/mL
b) 10 μg/mL

a)用于篩選

b)用于維持生長(zhǎng)

Ursic, et. al., Biochem. Biophys. Res. Comm., v. 101:3, 1031-1037 (1981).
酵母

a) 500 μg/mL 

b) 125-200 μg/mL

a)用于篩選

b)用于維持生長(zhǎng)

Jimenez and Davies, Nature, v. 287, 869-871 (1980).
細(xì)菌8-16 μg/mL用于篩選Waitz, et. al., Antimicrob. Agents Chemother., v. 6:5, 579-581 (1974).

 3. 殺滅曲線的建立

為了篩選得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株,需要確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的抗生素zui低濃度,可通過建立殺滅曲線(劑量反應(yīng)曲線)來實(shí)現(xiàn),至少選擇6個(gè)濃度。處理分裂期的細(xì)胞時(shí)G418的活性強(qiáng),因此在添加G418之前需要讓細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間。

1) *天:未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞按照20-25%的細(xì)胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上,37℃,CO2培養(yǎng)過夜;

對(duì)于需要更高密度來檢測(cè)活力的細(xì)胞,可增加接種量。

2) 根據(jù)細(xì)胞類型,設(shè)定合適范圍內(nèi)的濃度梯度。以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為例,可設(shè)定0,50,100,200,400,800,1000 μg/mL。

3) 第二天:去除舊的培養(yǎng)基,換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基。每個(gè)濃度做三個(gè)平行孔。

4) 接下來每3-4天更換新的含藥物培養(yǎng)基。

5) 按照固定的周期(如每2天)進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)來確定阻止未轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)的恰當(dāng)濃度。選擇在理想的天數(shù)(通常是7-10天)內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的zui低濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選用的工作濃度。

4. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選

4.1 轉(zhuǎn)染48 h后,用含有適當(dāng)濃度的G418篩選培養(yǎng)基來傳代細(xì)胞(直接傳代或者稀釋后傳代)。

細(xì)胞處于活躍分裂狀態(tài)時(shí)抗生素的殺傷效果超好。則當(dāng)細(xì)胞過于稠密,其效率會(huì)降低。為了得到較好的篩選效果,將細(xì)胞稀釋至豐度不超過25%。

4.2 每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液。

4.3 篩選7天后觀察并評(píng)估細(xì)胞克?。洌┑男纬汕闆r。集落的形成可能還需要一周或者更多的時(shí)間,這取決于宿主細(xì)胞類型,轉(zhuǎn)染,以及篩選效果。

4.4 挑取并轉(zhuǎn)移5-10個(gè)抗性克隆于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)板,繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天。

4.5 之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。

注意事項(xiàng)

1) 本品不可高壓滅菌;

2)不要和其他的抗生素/抗真菌劑(如青霉素/鏈霉素)共同使用,因?yàn)樗鼈兪荊418的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。其他的抗生素也會(huì)產(chǎn)生交叉活性。

3) 配制G418溶液時(shí),一定要根據(jù)G418批次不同的活力值(potency)來進(jìn)行換算,從而得到需要活性濃度的儲(chǔ)存液以及工作液。

4) G418加入培養(yǎng)體系中未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有可能不會(huì)被殺死,原因在于藥物濃度過低,或者細(xì)胞密度過高。另外,快速分裂的細(xì)胞相對(duì)于緩慢增殖細(xì)胞,更容易被殺死。對(duì)照細(xì)胞(未轉(zhuǎn)染)可能抗生素添加5-7天后才能殺死,轉(zhuǎn)染細(xì)胞(抗性克隆子)的克隆需要10-14天形成。

5) 即使加入殺死劑量的G418,細(xì)胞可能會(huì)繼續(xù)分裂2-3次。G418的藥效通常在2天后才變得明顯。

6) 為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

 

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